基因组学研究与色素发育遗传巧妙结合酵母单杂用于β-胡萝卜素研究

芒果（Mangifera indica L.）是世界上营养价值最丰富的食用水果之一。它拥有二倍体基因组（2n=2x=40个染色体），属于无患子目无患子科芒果属。芒果在世界热带和亚热带地区种植面积为250万公顷，年产量为4660万（Wang等人，2020年）。它是第五大经济作物，其次是香蕉、葡萄、苹果和柑橘（Deshpande et al.，2017）。其黄色果肉富含类胡萝卜素，这是一种参与植物生长和适应的重要天然色素，可增强人体免疫功能，减少癌症等疾病的发生（Sun等人，2017年）。因此，了解果实色泽的分子基础是芒果遗传改良的主要目标。β-胡萝卜素是影响成熟芒果果实色泽的主要类胡萝卜素（Ma等人，2018年）。然而，对于调控β-胡萝卜素生物合成从而影响芒果果实色泽的转录机制知之甚少。

中国热带农业科学院，热带果树创新团队王松标研究员等人在期刊 Front. Plant Sci 上发表了一篇题为 Chromosome-Scale Genome and Comparative Transcriptomic Analysis Reveal Transcriptional Regulators of β-Carotene Biosynthesis in Mango 的科研文献，本文使用来自美国佛罗里达州的品种“Irwin”组装了一个高质量的芒果基因组（396MB，contig N50=1.03MB），总共97.19%的序列锚定在20条染色体上，包括36756个蛋白质编码基因。作者比较了两个不同品种（“Irwin”和“Baixiangya”）生长期的β-胡萝卜素含量。β-胡萝卜素含量的变化主要影响果肉颜色。此外，转录组分析确定了与β-胡萝卜素生物合成相关的基因。MiPSY1被证明是调控β-胡萝卜素生物合成的关键基因。加权基因共表达网络分析、双荧光素酶和酵母单杂交分析证实转录因子（TFs）MibZIP66和MibHLH45通过直接结合MiPSY1启动子的CACGTG基序激活MiPSY1转录。然而，两种TFs对启动子活性没有明显的协同效应。目前的研究结果为研究芒果果实色泽的分子基础提供了基因组学平台。

研究结果

1. 基因组测序和组装

芒果基因组中总共有97.19%（375 Mb）的序列锚定在20条染色体上，染色体大小在12.8到29.8 Mb之间，一对一共线性块显示79.61%的基因组序列与84.75%的“Hong Xiang Ya”基因组序列相匹配（图1B），表明作者实验室的基因组序列更为完整。

图1 |（A）“Irwin”基因组概述（B） “Irwin”和“Hong Xiang Ya”基因组的共线性

2. 果实发育和成熟过程中类胡萝卜素基因的表达

研究β-胡萝卜素的变化及其生物合成的调控将有助于深入了解芒果果肉颜色的遗传基础。在果实发育和成熟过程中，“Irwin”芒果的β-胡萝卜素含量增加，而“Baixiangya”芒果的β-胡萝卜素含量保持较低。在完全成熟阶段，“Irwin”果肉中的β-胡萝卜素浓度高达50.06g/g鲜重，而“Baixiangya”果肉中的β-胡萝卜素浓度仅为2.64g鲜重（图2B）。这种β-胡萝卜素浓度的差异也通过水果的不同颜色在视觉上表现出来（图2A）。

图2 |“Baixiangya”和“Irwin”果实发育和成熟过程中果皮颜色及β-胡萝卜素浓度的变化

LCYB（Mango_gene10477）在果实发育早期，在“Irwin”中的表达水平明显高于在“Baixiangya”芒果中的表达水平。在果实成熟期间，其在“Irwin”中的表达水平几乎保持不变，但在“Baixiangya”芒果中的表达水平有所下降。同样，7号染色体上的Mango_gene22766在果实发育和成熟过程中在“Irwin”中表现出显著的高水平表达，但在“Baixiangya”芒果中的表达水平非常低。在完全成熟阶段（S3），根据qRT-PCR数据，“Irwin”的Mango_gene22766表达水平比“Baixiangya”高14倍（图4）。因此，这些基因的高表达水平可能导致β-胡萝卜素在芒果果实中的积累。

图4 |在果实发育和成熟过程中，“Baixiangya”和“Irwin”芒果果实中MiPSY1和七种选定转录因子（TFs）的相对表达水平

3. 亚细胞定位及双荧光素酶用于MiPSY1上候选TF的分离

将克隆的Mango_gene22766全长序列命名为MiPSY1。WoLF PSORT在线预测软件提示MiPSY1分布在线粒体中(http://www.genscript.com/wolfpsort.html)，为了检测其亚细胞定位，将MiPSY1与RFP融合并在拟南芥原生质体中瞬时表达。荧光显微镜分析显示MiPSY1蛋白定位于线粒体（图5）。总之，MiPSY1可能是调控芒果果肉中β-胡萝卜素形成的关键候选基因。

图5 |拟南芥原生质体中MiPSY1蛋白的亚细胞定位

进行双荧光素酶瞬时表达分析，以测试关键候选TFs对MiPSY1启动子的潜在调控作用。LUC/REN分析表明MibZIP66和MibHLH45可显著激活MiPSY1启动子，转录激活增量分别为2.7倍和2.3倍。其他五种TFs对MiPSY1启动子的作用有限。MibZIP66和MibHLH45的联合作用对MiPSY1启动子活性没有显著的加性效应（图6）。MibZIP66和MibHLH45仅定位于细胞核内（图7）。

图6 |双荧光素酶实验筛选转录因子( TFs )对MiPSY1启动子的调控作用

图7 | MibZIP66和MibHLH45蛋白在烟草（N.benthamiana）叶表皮细胞中的亚细胞定位

4. YIH 实验验证MiPSY1上候选TF的反式激活

转录因子在调控功能基因表达以控制植物重要性状的发育中起着关键作用。在本研究中，作者发现MibZIP66和MibHLH45的表达与MiPSY1表达和β-胡萝卜素含量相关，表明这两种TFs可能与β-胡萝卜素调控有关。

作者发现了两个CACGTG序列位于MiPSY1转录起始密码子上游的852和800 bp位置之间，进行了YIH实验和顺式元件突变。如图8所示，只有与阳性对照、pGADT7-MibZIP66+MibPSY1 WT启动子或pGADT7MibHLH45+MibPSY1 WT启动子共转化的酵母细胞在添加60或90 mM 3AT的选择性培养基SD/-His/Leu/-Trp上生长良好。当MiPSY1启动子的两个G盒元件CACGTGTG均突变为TCTAGC时，pGADT7-MibZIP66+MibPSY1 Mut启动子和pGADT7-MibHLH45+MibPSY1 Mut启动子无法在选择性培养基上生长（图8）。这些结果表明MibZIP66和MibHLH45可以特异性结合MiPSY1启动子的G-box基序（CACGTG）来调控MiPSY1在芒果果肉中的表达。结果证实MibZIP66和MibHLH45能够特异性结合并反式激活MiPSY1启动子。

图8 | MibZIP66和MibHLH45与MiPSY1的实际（WT）和突变（Mut）启动子结合的酵母单杂交分析

全文总结

在本研究中，作者非常巧妙的将大分子基因研究与果实品质指标类胡萝卜素的研究相互结合，使用单分子实时（SMRT）测序和高通量染色体构象捕获（Hi-C）技术对芒果品种“Irwin”的基因组进行了测序和分析。随后，对参与类胡萝卜素生物合成的基因进行了基因组和综合转录组分析，以探索β-胡萝卜素生物合成的分子机制及其在果实发育和成熟过程中的调控。此外，还发现了控制β-胡萝卜素合成关键结构基因表达的重要TF 。最近的一项研究表明，TF–TF相互作用可参与类胡萝卜素生物合成，因此，作者描述了一个优质品种的基因组，并阐明了芒果果肉颜色的遗传基础。在本研究中，MiLCYB在果实发育和成熟过程中表现出与β-胡萝卜素积累无关的表达模式。因此，作者推断MiPSY1是芒果果肉中β-胡萝卜素生物合成的关键控制点。

总之，“Irwin”基因组和芒果果实成熟过程中MiPSY1的转录调控对于扩大研究人员对色素发育遗传基础的理解是有价值的。这些基因组资源有望帮助加速芒果的遗传改良。

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本研究得到了中国国家科学基金（批准号31672103）、广东省国家科学基金（编号2021A15150 10966）和广东省现代农业产业技术创新专项基金（2019KJ108）的支持。

原文链接doi: 10.3389/fpls.2021.749108